im电竞科研 西北农大：一个简化的人工合成群落通过激活植物诱导的系统抗性来拯救蒙古黄芪根腐病（国人佳作）科研 西北农大：一个简化的人工合成群落通过激活植物诱导的系统抗性来拯救蒙古黄芪根腐病（国人佳作）
背景：植物的健康和生长受到病原菌侵染的负面影响，而植物可以动态调节其根际微生物群落，以适应这种生物胁迫。虽然植物招募的保护性微生物可以组装成合成群落，用于植物病害的防治，但根际微生物群落通常含有一些低丰度的类群。低丰度微生物在合成群落中的作用尚不清楚；而我们还不清楚是否所有被植物富集的微生物都能增强宿主对环境的适应能力。本研究基于根系相关细菌群落组成的差异分析组装了一个具有抗病功能的合成群落。我们进一步简化了合成群落，通过一个简单的合成群落研究了低丰度细菌在防治蒙古黄芪(Astragalus mongholicus)根腐病中的作用。
结果：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染降低了蒙古黄芪根际细菌Shannon多样性，显著影响了根际和根系细菌群落组成。在病原真菌的胁迫下，蒙古黄芪将一些有益细菌如Stenotrophomonas、Achromobacte、Pseudomonas和Flavobacterium引入根际和根内。我们构建了一个由10个高丰度细菌和3个低丰度细菌组成的抗病菌群。经过植物和病原菌的联合筛选，该复杂的合成群落进一步简化为由3个高丰度细菌(Stenotrophomonassp.、Rhizobiumsp.、Ochrobactrum sp.)和1个低丰度细菌(Advenellasp.)组成的一个4种菌种合成群落。值得注意的是，包含这4种菌株的简单群落和13种菌种群落对根腐病的防治效果相似。此外，简单群落通过高丰度细菌抑制病原真菌生长和低丰度细菌激活植物ISR协同作用来保护植物。
结论：本研究结果表明，低丰度细菌在合成群落中发挥重要作用，只有少数细菌类群富集在病根中与抗病有关。因此，构建和简化合成群落可能是植物适应环境胁迫的一种策略。
通讯作者单位：西北农林科技大学生命科学学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西省农业与环境微生物重点实验室
如图1所示，病根菌群中假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、泛菌属(Pantoea)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)丰度较高，而Plectosphaerella、头束霉属(Cephalotrichum)和镰刀菌属(Fusarium)在病根真菌群落中具有较高的丰度。根据前人的研究，青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、链格孢菌(Alternariasp.)和Phytophthora incognitae是潜在的根腐病病原菌。然而，在高度丰富的OTUs中，没有观察到可以从病根聚集到已知属中的潜在致病细菌(图1a)。相比之下，镰刀菌属(Fusarium)(8.79%)和链格孢菌(Alternaria)(1.30%)占病根中线b)。镰刀菌在患病植株的根部显著富集；然而，健康和病根之间的链格孢菌丰度没有差异(图1c和d)。此外，从患病黄芪中分离出53株可培养真菌，包括尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌和烟草赤星病菌(Alternaria alternata)。根据盆栽试验结果，只有尖孢镰刀菌发病率高，植株表现出典型的根腐病症状：叶片卷曲、植株矮小、根系褐变、腐烂(图1e和图f)。因此，该真菌在后续试验中作为指示菌使用。
a具有根腐病症状的大田植物的优势细菌属。b具有根腐病症状的大田植物的优势真菌属。观察到与根腐病相关的2个真菌属(Fusarium和Alternaria)。c和dFusarium和Alternaria在健康和病根、根际和非根际土壤中的相对丰度; HBS,健康非根际土壤;DBS:患病非根际土壤; HRS,健康根际; DRS,患病根际; HR,健康根;DR,病根。e黄芪根腐病的发病与真菌病原感染有关。f有无F. oxysporum侵染的植物的茎、根性状。
根据16S扩增子测序结果，共获得高质量的细菌reads 2,287,677条。去除低质量和植物来源的reads后im电竞官方网站，剩余的reads以≥97%的序列同源性聚类成7547个细菌OTUs。健康根和病根中发现的大部分细菌OTUs也存在于根际。然而，相当一部分细菌仅在患病的根际和根中观察到(分别为9.2%和0.6%)，尽管与患病植物相关的大部分OTUs也存在于健康植物的根际和根中(图s2)。 从图2a可以看出，在尖孢镰刀菌存在和不存在的情况下，细菌群落的Shannon α-多样性从非根际土壤到根系逐渐降低（健康根:F2, 33= 90.96, P ＜0.001;病根:F 2, 33 = 84.78, P＜0.001），说明植物对细菌在根系定殖具有很强的选择作用。此外，尖孢镰刀菌的侵染降低了根系细菌群落的Shannon α-多样性，但不影响非根际土壤和根际的α-多样性(根际:F1, 22 = 0.48, P＜0.50; 根:F1, 22= 9.71, P=0.005)(图s3和表s2)。基于Bray-Curtis的主坐标分析(PCoA)表明，健康植物与患病植物根和根际细菌群落组成存在显著差异。健康根与病根的内生菌群落组成差异大于根际差异(根:R2=0.25, P=0.001;根际:R2=0.10, P=0.011)(图2b)。三元图还显示，病根和根际中富集的许多细菌OTUs与健康植株中富集的细菌OTUs存在显著差异(图2c)。然而，在非根际土壤样品中没有观察到差异。结果表明，在尖孢镰刀菌胁迫下，植物招募一定数量的微生物在根际和根部定植。
图2 尖孢镰刀菌对根际和根系细菌群落结构的影响。a健康与患病植物非根际土壤、根际和根系中细菌的Shannon多样性。星号表示有统计学意义(*P＜0.05;* * P＜0.01)，采用Dunn多重比较检验进行方差分析。b基于Bray-Curtis距离的根际微生物群落主坐标分析(PCoA)。真菌病原感染改变了细菌群落结构。c利用Kruskal Wallis检验分析了健康和患病植物三个区室细菌属的丰度和富集度的差异。病根及根际中富集的细菌属与健康根不同。
OTU分类结果显示，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是根和根际的优势菌门，占总reads的86.7-98%，而变形菌门(Proteobacteria)(30.4%)、放线菌门(Actinobacteria)(25.6%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(13.1%)、和绿弯菌门(Chloroflexi)(8.8%)主导了非根际土壤细菌群落(图3a)。与非根际土壤相比，根际显著富集变形菌和放线菌，根际显著富集变形菌(图s4)。尖孢镰刀菌感染也会影响根相关细菌的群落组成。受病原菌感染影响显著的菌门为根内变形菌门和拟杆菌门，根际放线菌门和拟杆菌门。而非根际土壤细菌门丰度不受尖孢镰刀菌的影响(图4和图s5)。
前40个属的热图显示，健康根和病根的细菌群落是分开聚集的。然而，根际细菌群落无法区分健康植株和患病植株(图3c)im电竞官方网站，说明尖孢镰刀菌侵染对根系细菌群落结构的影响大于对根际细菌群落结构的影响。为了研究真菌病原菌侵染植物时，哪些细菌被植物根系招募，我们分析了健康植物和患病植物之间的差异细菌。结果表明，病根中Stenotrophomonas、Pseudomonas和黄杆菌属(Flavobacterium)高度富集(图5a)，而根瘤菌科(Rhizobiaceae)和黄杆菌目(Flavobacteriales)在患病植物根际富集(图s6)。
图3 健康植物与患病植物不同区室间的植物相关细菌群落组成。a健康植物和病害植物不同室主要细菌门的分布和丰度。b病原真菌侵染对不同区室细菌群落组成及主要菌门丰度的影响。c结合聚类分析的细菌群落组成热图。相似样本水平聚类，垂直模式显示样本间前40个细菌属的系统发育关系。HBS，健康非根际土壤; DBS:患病非根际土壤; HRS,健康根际; DRS,患病根际;HR，健康根;DR,病根。
图4 真菌致病菌对健康和患病植物细菌组成的影响。病根和健康根及根际的优势菌门和属。左半圆由外到内表示优势门、优势属以及各属在不同样品中的比例。右半圆代表不同的样本。
16S rRNA测序结果表明，病根的细菌群落组成与健康根有显著差异。为了研究从患病植物中招募的细菌是否改变了细菌群落的功能谱，我们首先通过PICRUSt软件预测了群落功能，健康根际和患病根际细菌群落功能谱不同。在患病植物的根际和根系中，这些功能与“环境适应”、“细胞运动”、“信号转导”和“次生代谢产物的生物合成”有关(图5c和d和表s3)。接下来，我们分析了病根中富集的OTUs与病原真菌的关系。互作网络分析结果表明，Stenotrophomonas、Pseudomonas和Flavobacterium的丰度与镰刀菌的生长呈负相关(图5b)。
图5 病原菌感染后细菌群落的分类和功能特征。a健康和患病样本细菌的LefSe分析Cladogram图。不同的分类层次由内向外呈现。红色节点表示在病根中富集属，节点表示无差异，绿色节点表示在健康根中富集属。HR，健康根;DR,病根。b用Spearman相关性计算根系相关细菌(相对丰度＞0.001)和镰刀菌( Fusarium )间的关系。用相关系数大于0.6的细菌构建网络。红色和绿色线表示细菌的相对丰度与Fusarium呈正相关或负相关。c根和d根际功能概况。色标代表预测功能的丰富或减少。
为了进一步评估招募的细菌对黄芪健康的影响，我们采用0.1×、0.2×和0.5× TSA、R2A和LB平板分别从健康和患病黄芪的根际和根中分离出423株细菌。根据16S rRNA测序结果，分离株来自74个属。其中，44株可溶解有机P，65株可溶解无机P，40株可溶解K，80株能产生IAA(图s7)。
在相对丰度比为2的阈值下，病根中有39个细菌属富集，137个细菌属减少(表s4和s5)。F. oxysporum感染导致根内细菌属如Pseudomonas、Strenotrophomonas、Chryseobacterium、Achromobacter和Flavobacterium显著增加，Pantoea、Parablastomonas和微杆菌属(Microbacterium)减少(图5a)。我们从39个富集属中分离出16个菌属，从137个减少属中分离出11个菌属，每个属包含2~8个种。然后我们根据它们的拮抗或植物生长促进特性从10个高丰度(＞0.1%)和3个低丰度属(＜0.1%)分别筛选出1个物种。然后，我们将所有物种与等体积的悬浮液(~ 108个细胞/L)混合，形成合成群落I (SCI，图s8和表s1)。为了研究富集菌是否能防止病原真菌侵染黄芪，我们还选择了相对丰度降低的9个物种和4个随机物种构建合成群落II (SCII)(图6a、图s9和表s1)。
两种人工菌群处理植株生长20 d后，SCI处理植株的根长分别比未接种和SCII处理的植株长70.50%和54.33%，而SCI处理的株高分别比对照和SCII处理的株高高34.48%和20.56%(图6b和c)。SCII处理的根长和株高与对照无显著差异。此外，SCI和SCII处理均未影响植株鲜重、干重和叶绿素含量(图6d和e)。
根据盆栽试验结果，SCI和SCII对根腐病发病率也有不同的影响(图6f和g)。接种尖孢镰刀菌12 d后，SCI显著降低黄芪根腐病发病率；接种后20 d，SCI处理植株的平均发病率和死亡率分别比对照低26.32%和23.64%。
图6 合成细菌群落组装及其对黄芪根腐病的调控作用。a构建合成细菌群落的过程。采用培养法从根际和根中尽可能多地分离细菌，并对健康根和病根的不同菌株进行分析。随后，分别用病根中富集菌和非富集菌组装合成菌群I (SCI)和合成菌群II (SCII)。b-eSCI和SCII对接种20 d后植株根长、株高、叶绿素含量(n = 20)和干重(n = 4)的影响。在线 d前接种合成菌群，每株接种2 mL合成菌群悬浮液(~108CFU/mL)。星号表示显著差异(P＜0.05)。f-gSCI和SCII对接种后不同时间点根腐病发病率和植株死亡率的影响(n = 45)。每株植株接种2 mL尖孢镰刀菌孢子悬浮液(~105孢子/L)。
SCI在土壤中接种30 d后，根和根际仅能恢复到以寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)、根瘤菌(Rhizobiumsp.)、小陌生菌(Advenellasp.)和苍白杆菌(Ochrobactrumsp.)，Stenotrophomonassp.为优势种(图7a)。然而，有趣的是，由4种菌种组成的简单群落(SCIII)也能降低根腐病发病率和植株死亡率(图7b, n = 12, P＜0.001, Tukey检验)。此外，SCI和SCIII处理的病苗数量显著低于对照和SCII处理植株。SCI和SCIII处理植株的病苗数量无明显差异(图7b和图s10)。在构建简单合成菌群时，我们还测定了不同比例的高丰度菌与低丰度菌混合的防治效果。结果表明，减少Advenellasp.和Ochrobactrumsp.的数量并不影响简单合成菌群对黄芪根腐病的调控作用(图7c)。
图7 合成细菌群落I的简化及其防治效果。aSCIII是由宿主植物和尖孢镰刀菌共同选择存活的Stenotrophomonassp.、Rhizobium sp.、Advenellasp.和Ochrobactrum sp.混合构建而成。柱状图显示了四种菌株在根中的丰度。b不同菌群接种植株15 d后根腐病发病情况。SCI,合成群落I; SCII,合成群落II; SCIII,4种菌种组成的简单群落。c不同细菌处理的尖孢镰刀菌菌落半径在生长6 d后的变化(n = 3)。d不同比例混合菌接种黄芪的根腐病发生率。星号表示显著差异(Tukey检验,P＜0.01)。
Stenotrophomonassp.是SCIII中唯一能抑制尖孢镰刀菌生长的细菌。我们很想知道另外三种细菌(Advenellasp.、Rhizobiumsp.和Ochrobactrumsp.)的存在是否在根腐病的控制中发挥作用。因此，我们通过使用单一菌种与SCIII进行比较，研究其对黄芪根腐病发病率的影响。虽然四种细菌都能显著降低植物死亡率，但Stenotrophomonassp.、Rhizobiumsp.和Ochrobactrumsp.并没有显著降低宿主植物的根腐病发病率(图8a和b)。在4种菌种中，只有Advenellasp.(丰度最低)显著降低了植株病害发病率(~33.3%)和死亡率(~100%)。而SCIII的根腐病发病率降低了42.7%，明显优于其他单株细菌，表明合成菌群对病原菌侵染的防御效果优于单株细菌。此外，所有接种处理均能促进植物生长。Rhizobiumsp.、Advenellasp.和SCIII处理植株的株高和根长增加最多(图8c和d)；而且SCIII处理可以显著提高植株的鲜重和干重(图8e和f)。
然后我们比较了SCI、SCII、SCIII、SCIII-10、SCIII-100和SCIII-600(高丰度和低丰度细菌混合比例为10:1、100:1和600:1)对植物ISR的激活。5d后，SCI、SCIII和SCIII不同配比处理植株的POD、PPO、PAL、LOX和几丁质酶活性无显著差异。SCII处理植株的所有酶活性均高于未处理对照，但明显低于其他合成群落处理植株(图9)。
干旱、肥力、pH值、病原真菌和线虫等环境条件可以改变植物的代谢途径，并诱导产生特定的根系分泌物，这些分泌物选择性地从周围土壤中招募微生物定植到根际或根中。由此产生的复杂微生物群落可以增强宿主植物对不利环境的抵抗力或耐受性。生物和非生物胁迫下，小麦、玉米、水稻、高粱等植物根际微生物群落的组成已被广泛研究，然而，目前还不清楚微生物群落的哪些成员直接影响植物的性能。确定在这种条件下影响植物性能的关键微生物的一个潜在方法是模拟自然条件，构建合成微生物群，并分析它们与宿主植物生长、代谢和耐受性的相关性。
在目前的研究中，我们发现无论是否存在尖孢镰刀菌，根系细菌群落α多样性都明显低于根际和非根际土壤，这与之前的研究结果一致，表明植物根系对土壤微生物有很强的过滤作用。病原菌侵染显著降低了根内生细菌群落的Shannon多样性，这可能是由于与疾病防御相关的细菌在根部高度富集。与健康植物相比，患病黄芪根中Pseudomonas、Stenotrophomonas、Arthrobacter和Flavobacterium的富集程度较高。Pseudomonas和Stenotrophomonas的丰度最高，在健康根中分别为3.33%和2.97%，在病根中分别为19.17%和13.19%。病根中前10个富集菌属占根内生细菌群落的59.6%。据报道，这些菌属中的许多菌株都能促进植物生长和提高植物的抗病能力。根相关细菌群落的功能分布在不同样本中呈现出不同的模式。根系相关群落的生物膜形成、链霉素生物合成、聚酮生物合成、脂多糖生物合成等功能与植物的抗病能力有关。生物膜可以帮助植物吸收养分，作为生物防治剂对抗疾病。拟南芥（Arabidopsis）霜霉病感染导致三种细菌组合的形成，在生物膜形成中协同作用，降低疾病发病率。聚酮和链霉素是抑制细菌和真菌生长的常用抗生素，在病原菌胁迫下，聚酮环化酶基因的表达量显著增加。革兰氏阴性细菌产生的脂多糖可以作为诱导剂，诱导植物的防御反应。结果表明，尖孢镰刀菌侵染可以改变黄芪根系相关微生物群落的组合，并引入防治根腐病的特异性微生物im电竞官方网站。在我们的研究中，大多数细菌都是从病根和健康根中分离出来的，表明健康植物根上聚集的群落也具有防治病害的潜力。然而，植物在自然条件下生长时，会同时受到各种生物和非生物因素的胁迫。在本研究中，不同生态功能的微生物在根际和根系中富集，即使在接种病原菌的情况下，植物中富集的微生物也并不都与抗病有关。不同细菌的组合以及确定相容且生态稳定的群落是一项费时费力的工作。通过分析患病植物的微生物群落组成，筛选微生物菌株，构建适宜的组合，提高抗病微生物群落的组装效率。
土壤微生物多样性远高于16S高通量测序所观察到的多样性，目前还不清楚植物能从土壤中招募多少种微生物来执行特定的功能。在早期的研究中，合成群落中的细菌数量从几个到几十个不等。目前还不清楚是否部分或全部招募的细菌参与了植物抗病。因此，构建合成细菌群落有助于回答上述问题。
在本研究中，我们发现由39个显著富集在黄芪根中的13个细菌属组成的合成细菌群落(SCI)可以显著缓解植物病害。进一步的研究表明，合成菌群对植物根腐病的防治效果仍然保持在SCI中4种细菌的水平，说明并非所有富集菌都参与了对病原真菌的抗性。本研究发现，Stenotrophomonassp.、Rhizobiumsp.、Advenellasp.和Ochrobactrumsp.是控制植物根腐病的关键菌种。Stenotrophomonassp.、Rhizobium sp.、Ochrobactrumsp.和Advenellasp.的相对丰度比约为600:200:10:1。我们还测试了不同比例的四种菌种对根腐病的防治效果，发现四种植物群落在不同比例的情况下都能有效预防根腐病。这一结果表明，一些细菌在低浓度下也能发挥作用。为了吸引土壤中的相关微生物，植物需要通过根部释放5-21%的光合产物。此外，根际或根中微生物的富集越多，维持微生物的生长和繁殖所需的资源就越多；因此，植物作为众多微生物的宿主资源密集。此外，尽管微生物群落在根或根际定殖是控制土传疾病的必要步骤，但群落中众多菌株的存在可能会增加它们之间的竞争。因此，植物倾向于富集少数微生物来执行特定的功能。例如，具有霜霉病的拟南芥在根际招募Microbacterium sp.、Stenotrophomonas sp.和Xanthomonassp.，Niu等人观察到7种菌株的细菌组合延缓了轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)的生长。因此，在构建合成菌群时，应注重菌株的最佳组合，而不是菌株的数量。
通过培养方法分离植物招募细菌，在一个属内获得多个菌种；因此，选择合适的细菌种类进行合成群落组装至关重要。考虑到有益微生物可以通过促进和拮抗生长来提高植物的抗病性，我们选择了具有这种特性的细菌用于细菌群落的组装。SCI对根腐病有显著的防治效果；SCII中含有能通过产生生物活性物质抑制病原菌生长的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)，但对黄芪根腐病没有明显的缓解作用。虽然SCI可以降低黄芪根腐病的发病率，但我们发现含有4种菌种的合成群落对根腐病的防治效果相同。因此，其他来自SCI的细菌种类是否能够参与根腐病的缓解还有待验证。如今，许多生物防治药剂的制备都是以实验室中候选菌株对病原体具有拮抗作用为前提的；然而，这种影响可能不会在现场观察到。因此，研究利用植物招募的细菌组装合成细菌群落，有助于宿主植物的抗逆性。
植物通过产生抗生素、营养竞争、促进植物生长或诱导性系统抗性，招募不同的微生物来控制植物病害。有研究报道，根际微生物群落多样性和某些物种丰度的降低使植物更容易受到病原菌的侵染。但是，不能排除合成群落中组分相对丰度的影响。低丰度微生物的存在也有助于容纳更多种类的微生物，这些微生物的根袭分泌物有限，这可能有利于植物的生长、耐受性和植物的整体健康。细菌群落除了具有抑制病原真菌和促进植物生长的作用外，还可以激活植物免疫，防止病原体感染。因此，我们也研究了不同合成群落对黄芪ISR的影响。除SCII外，SCI和SCIII均能显著激活植株ISR，降低Ochrobactrumsp.和Advenella sp.的丰度，但没有削弱SCIII的防治效果。尽管低丰度的Ochrobactrumsp.和Advenellasp.不能直接抑制F. oxysporum生长，但它对植物中JA和ISR相关酶活性的激活作用比Stenotrophomonassp.更大，表明这两种低丰度细菌可能通过JA信号通路诱导植物抗性。缺乏JA合成代谢途径的植物更容易受到病原菌侵染，而增加JA积累可显著降低侵染发生率。
有报道称，一些有益的根际细菌在与植物互作过程中可以激活JA合成途径。JA诱导的途径也产生几丁质酶和氧化酶(例如，PAL、POD、PPO和LOX)，提高PAL和POD活性可促进酚类物质的生成和木质素化，防止病原菌侵染。
综上所述，高丰度细菌通过促进植物生长和抑制病原菌生长来保护宿主，而低丰度细菌通过提高植物ISR来控制病害。此外，高丰度和低丰度细菌菌种的组合比任何单一菌种诱导更大的系统抗性。本文的发现可以为促进功能性合成群落的组装提供参考，并强调了一种可用于实现可持续农业的潜在解决方案。
利用新一代测序方法，本文发现病害植物的根内生细菌群落组成与健康植物明显不同。特别是在尖孢镰刀菌胁迫下，植物根系招募了一些有益微生物，如Pseudomonas、Strenotrophomonas、Chryseobacterium、Achromobacter和Flavobacterium。3个低丰度细菌和10个高丰度细菌在黄芪病根中富集，可作为合成群落有效防治黄芪根腐病。以上述菌群为基础的简化合成菌群，仅含有4种细菌却维持了原有效果。进一步的研究表明，高丰度细菌主要抑制病原真菌的生长，而低丰度细菌主要与激活植物ISR来缓解黄芪根腐病有关。本研究结果表明，不同生态功能的细菌可以组装成合成细菌群落，用于防治土传病害，这种功能性合成群落可以作为可持续农业的一种潜在解决方案。
